一、 技术背景

         E. coli 表达是重要的原核表达体系。将含目的基因的原核表达载体重组质粒转入带有 T7 RNA 聚合酶编码区段的大肠杆菌菌株中进行蛋白表达。这些宿主菌是噬菌体 DE3 的溶原菌，DE3 是噬菌体的 lamda 衍生体，有 phage21 的免疫区并携带 LacI 基因、lacUV5 启动子和 T7 RNA 聚合酶基因。此片段被插入到int 基因中，从而在没有辅助噬菌体的情况下防止 DE3 整合入染色体或者从染色体上切除。形成 DE3 溶源菌后，lacUV5 控制 T7 RNA 聚合酶的转录，而这个启动子受 IPTG 诱导。诱导后产生的 T7 RNA 聚合酶则可以结合到表达载体（如PET 系列载体）的 T7 启动子区，从而转录目的基因进而翻译产生目的蛋白。

        蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异，利用这些差异可将蛋白从混合物如大肠杆菌裂解物中提取出来得到重组蛋白。

二、 技术流程

   已构建好的载体转化到大肠杆菌中——小量表达蛋白——探索表达条件——收集菌体破碎——取上清进行 SDS-PAGE 检测——确定表达条件小量表达纯化——探索纯化条件——大量纯化蛋白——SDS-PAGE 检测——考马斯亮蓝染色

三、 技术风险

        主要是实验的未知性，由于表达蛋白的诱导条件的未知，适合的载体以及菌株也是未知，以及不同蛋白的表达情况不同，所有结果没有保证性。

此外每个蛋白的特性不一样，因此纯化条件也不确定，均为探索性实验。

四、 常见问题

1. 样本如何取材？

构好的质粒或者已经转化的菌株保存于-20℃或者-80℃。

2. 样本如何运输？

干冰运输即可。避免反复冻融，导致菌株没有活性。

3. 蛋白表达实验我们需要提供什么信息？

您需提供质粒或者已经表达好的菌株，目标基因的具体大小及基因号信息以及相关文献资料。

五、 课题结题报告

附录一：蛋白 A 表达及纯化实验

一、 实验试剂及仪器

1. 实验试剂

2、实验仪器

二、 实验方法

预表达蛋白

1. 将 A-PGEX4T2 载体转化到 BL21 中，37℃生长过夜；

2. 挑取单克隆到 2ml LB（Amp）中，37℃振荡 4h，吸取 50ml 转至 4 个 5mlLB(Amp)中，37℃震荡培养到 OD=0.6 左右，加 IPTG 0、0.5mM、0.7mM 及

1mM 到 LB 中，转移至 25℃诱导表达 10-12h；

3. 收菌，去上清后用 300ul 1×PBS 悬浮起来，超声波破碎；

4. 4℃离心 5min,12000rpm，吸上清，加入 loading buffer 后，煮 10min；

5. 制 10％的 SDS-PAGE 胶，点样，80V 电泳 2.5h 后，转膜，40v 恒压转膜 3h,4℃；

6. 封闭，用 5％的脱脂奶粉（TPST）室温封闭 1h 后，一抗封闭 12h, 4℃；

7. TPST 洗 3 次，每次 10min;

8. 二抗杂交 1h,室温；再重复 7 步骤；

9. 化学发光仪显影。

大量表达蛋白纯化

1. 经过预实验筛选诱导表达条件后，进行大量表达，方法预与实验一样，但是

体积扩大到 3L；

2. 利用金斯瑞公司的 GST 纯化柱子，按照说明说步骤纯化蛋白；

3. 将纯化的蛋白每 2ml 装一管，取样进行 SDS-PAGE 检测。

三、 实验结果

1. 预表达结果

点样顺序：1（0 上清），2（0 沉淀），3（0.5 上清），4（0.5 沉淀），5（0.7 上清），6（0.7 沉淀），7（1 上清），8（1 沉淀），括号里数字代表 IPTG 浓度。

结果表明 A-GST 蛋白在 0.5mM-1mM 浓度 IPTG 下都能诱导表达，所以选择

0.5mM IPTG 浓度在 OD=0.6，25℃诱导表达 10-12h。

2. 表达纯化结果（3L）

在 0.5mM IPTG 浓度在 OD=0.6，25℃诱导表达 10-12h 后，通过 GST 柱子纯化蛋白，SDS-PAGE 电泳后结果如下：

M     A-GST     1     2     3     4     5     6     7

蛋白纯化效果很好，带单一，浓度高。-80℃保存。