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EMSA | 一文解决你 80% 的实验细节问题

2018-09-14行业新闻   作者:

EMSA | 一文解决你 80% 的实验细节问题


​一、EMSA 是什么?

        EMSA 称凝聚阻滞实验或凝胶电泳迁移率检测, 是一种用于研究转录因子和其相关的 DNA 结合序列相互作用的技术, 能对各类转录因子的 DNA 结合活性进行定性和半定量分析,是一项研究细胞信号转导通路的关键实验技术。

二、EMSA 怎么做?

         EMSA 主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针,当核酸探针与样本蛋白混合孵育时,样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物;这种复合物由于分子量大,在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则较快;孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后,蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带,说明有蛋白与目标探针有互作。

三、EMSA 的特异性

        常用实验技术中免疫组化、 免疫印迹 ( WesternBlotting) 和 EMSA 均可用于转录因子检测, 但三者的侧重点各有不同。免疫组化或免疫荧光技术可以较准确的反应转录因子的表达部位和表达细胞, Western Blotting 可以精确定量转录因子。但并非所有转录因子均可以与 DNA 结合以刺激基因转录, 唯有 EMSA 技术可以反映转录因子是否具有 DNA 结合活性,故 EMSA 是证明细胞信号转导通路最终效应的必要实验技术。

        Xiaoyan W, et al. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2015

四、常见的试验问题

1、为什么看不到迁移带?

1)蛋白样本提取质量不高,蛋白降解或者提取量不足。

2)样本中没有可以与探针结合的蛋白。

3)探针与蛋白无特异性的相互作用。

4)转膜效率低,蛋白或者探针未转移到膜上。

5)曝光或者成像时间过短。

6) 在 Super-Shift EMSA 测定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因:

        a. 抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于 Super-Shift EMSA,只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于 Super-Shift EMSA。

        b. 测定的活化的 DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到 Super-Shift 的带,也看不到 DNA/蛋白复合物的量的减少。

        c. 使用的抗体过度稀释。一般 10~20 ul 的反应液需要使用 0.5~1 ul 原倍的抗体。

        d. 多抗与 DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到 Super-Shift 的带,但应当可以看到 DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

2、为什么实验背景高?

       1)曝光或者成像时间过长。

       2)封闭时间不足或者效率不高。

       3)洗涤效果不佳。

       4)实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

3、EMSA 测定需要多少量的蛋白与标记的探针?

        对每一个特定的结合蛋白和探针,所用的纯化蛋白,部分纯化蛋白,粗制核抽提液需作优化:一般所用纯化蛋白的量在 20~2 000 ug 间,用粗制核抽提液,需要 2~10 ug 蛋白形成特异的复合物。部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在 -80 ℃、探针应保存在 -20 ℃ 以防止降解。

      无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。

4、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开?

        将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合,蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为 6%,在特定条件下可用高或低的浓度。也可将 TGE 缓冲液(12.5 mM Tris,pH8.3,95 mM 甘氨酸,0.5 mM EDTA)用于不稳定的蛋白/DNA 复合物。在 4 ℃ 进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。

5、Poly(dI:dC),非特异性竞争 DNA,特异性竞争 DNA 在 EMSA 测定中的作用?

        Poly(dI:dC) 由肌苷和胞嘧啶组成。在 EMSA 反应中加入 poly(dI:dC),可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的 poly(dI:dC) 的用量需在正式实验前进行优化,一般用量大约在 0.05 mg/ml 左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时,不必一定加入 poly(dI:dC),如加入,则普通反应中所用终浓度不超过 50~100 ug。对核抽提液,每 2~3 ug 核抽提液用 1 ug poly(dI:dC)。

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