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ELISA相关检测


实验原理

ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体,也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。


实验流程

◆夹心法ELISA:


1.加样:将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔100 μL。待测样品加入到其他孔,每孔100 μL(若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜,37℃孵育90分钟。提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。

2.生物素化抗体/抗原:弃去液体,甩干,不用洗涤。每个孔中立即加入生物素化抗体/抗原工作液100 μL,混匀,酶标板加上覆膜, 37℃孵育1小时。

3.洗涤:甩尽孔内液体,每孔加洗涤液350 μL,浸泡1-2分钟,吸去或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示:此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。

4.HRP酶结合物:每孔加酶结合物工作液100 μL,混匀,加上覆膜,37℃孵育30分钟。

5.洗涤:弃去孔内液体,洗板5次,方法同步骤3。

6.底物:每孔加底物溶液(TMB) 90 μL,混匀,加上覆膜,37℃避光孵育15分钟左右。提示:根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间,但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。

7.终止:每孔加终止液50 μL,终止反应。提示:终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

8.读值:立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热,设置好检测程序。

9.实验完毕后,将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至保质期。

 

◆竞争法ELISA:


1.加样:将标准品工作液依次加入到前两列孔中,每个浓度的工作液并列加两孔,每孔50 μL。待测样品加入到其他孔,每孔50 μL(若样本浓度高于检测范围,需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。立即每孔加入配好的生物素化抗体工作液50 μL。混匀,给酶标板覆膜,37℃孵育45分钟。提示:加样时将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,避免产生气泡。加样时间宜控制在10分钟内。

2.洗涤:甩尽孔内液体,每孔加洗涤液350 μL,浸泡1-2分钟,吸去或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。提示:此处与其他洗板步骤都可用洗板机。每一步洗涤充分是实验的根本。

3.HRP酶结合物:每孔加酶结合物工作液100 μL,混匀,加上覆膜,37℃孵育30分钟。

4.洗涤:弃去孔内液体,洗板5次,方法同步骤2。

5.底物:每孔加底物溶液(TMB) 90 μL,混匀,加上覆膜,37℃避光孵育15分钟左右。提示:根据实际显色情况酌情缩短或延长孵育时间,但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时,即可终止。

6.终止:每孔加终止液50 μL,终止反应。提示:终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

7.读值:立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪预热,设置好检测程序。

8.实验完毕后,将未用完的试剂按规定的保存温度放回冰箱保存至保质期。


结果展示




ELISA样本处理方法


可用于ELISA实验的样本一般有血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法也不同。适当的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里,我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。

1.血清

血清是ELISA实验最常用的样本,其预处理也十分简单。

使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本,将试管或离心管在室温下放置2小时或4℃过夜,分离出血清(建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面,使血清可以更大程度地分离出来)。4℃下以1000×g离心20分钟,小心收集上清液(血清),立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存,避免反复冻融。

在收集血液样本的过程中应避免溶血,因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质,这种情况下,ELISA实验中将会出现非特异性显色反应,导致检测结果不准确,出现假阳性结果。另外,样本还应避免细菌污染,因为细菌可能含有内源性HRP,也会导致检测结果不准确。 

2.血浆

使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本,采集后30分钟内,4℃下以1000×g离心15分钟,小心收集上清液(血浆)。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存,避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。常见的抗凝剂包括EDTA,肝素钠,枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书,查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。

3.细胞培养上清

将细胞培养上清液吸入离心管中并以1000×g离心20分钟,除去细胞碎片和杂质,收集上清液备用,样本保存在-20℃或-80℃,避免反复冻融。

4.细胞

反复冻融方法:

(1)吸出培养板中的培养基,用胰蛋白酶消化细胞,然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。

(2)将细胞悬浮液收集到离心管中,以1000×g离心10分钟,然后吸去培养基,用预冷PBS洗涤细胞3次。

(3)加入适量的预冷PBS(建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂)重悬细胞。在6孔培养板中,每个孔需要150-250μL的PBS来重悬细胞。

(4)使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融,重复冻融过程数次,直至细胞完全裂解。也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。

(5)4℃下以10,000×g离心10分钟,去除细胞碎片,收集上清液, -20℃或-80℃保存,避免反复冻融。

5.组织匀浆

(1)用预冷的PBS(0.01M,PH7.4)冲洗组织以除去表面残留的血液或杂质。

(2)将组织块称重,然后切成尽可能小的碎块,以便充分匀浆。

(3)加入适量的预冷PBS(体积取决于组织的重量,9 mL PBS适用于1 g组织,建议使用前立即在PBS中加入适量蛋白酶抑制剂),用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。

(4)将匀浆液吸入离心管中,4℃ 下以5000×g离心5~10分钟,收集上清液,保存至-20℃或-80℃,避免反复冻融。

6.尿液、唾液及其他生物体液以1000×g离心20分钟,收集上清液,立即进行测定。

一般来说,由于ELISA实验只能检测可溶性蛋白质的含量,因此要求样本应清晰透明并离心除去沉淀物或悬浮物质。为确保实验的准确性, -20℃或-80℃保存的样本应在1-6个月内完成检测,4℃保存的样本在一周内完成检测。此外,样本中不能含有会抑制HRP活性的NaN3,否则会造成假阴性结果。



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